Міщенко А. М. Розробка і використання ДНК-маркерів для ідентифікації сортів ліщини української селекції

Культурна ліщина європейська (Corylus avellana L.) або фундук є важливою горіхоплідною культурою з високим комерційним потенціалом, промислове виробництво якої неможливе без точного контролю сортового складу насаджень. Помилки при розмноженні садивного матеріалу призводять до значних економічних втрат для виробників і селекціонерів. Тривалий час єдиним інструментом сортової ідентифікації залишався морфологічний аналіз за дескрипторами UPOV, проте значна фенотипова мінливість морфологічних ознак фундука під впливом умов вирощування та вікових змін суттєво обмежує його надійність, особливо при ідентифікації близькоспоріднених генотипів. Вирішення цієї проблеми в сучасній практиці пов'язане з використанням ДНК-маркерів, які характеризуються стабільністю результатів незалежно від умов вирощування та стадії розвитку рослини. Незважаючи на успіхи молекулярної ідентифікації фундука у світовій практиці, генетична характеристика та паспортизація сортів вітчизняної селекції до початку даного дослідження не проводилася, що обумовило актуальність та практичну значущість роботи. Дисертаційне дослідження відповідає плану науково-дослідних робіт відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і виконувалося в рамках бюджетних тем відділу: «Генетичні і фізіолого-біохімічні механізми адаптації рослин до екстремальних умов довкілля» (номер держреєстрації 0120U105249, 2021-2025 рр.), «Геномна мінливість і особливості накопичення специфічних біологічно активних сполук у культурі тканин лікарських рослин» (номер держреєстрації 0125U002734, 2026-2030 рр.), а також при співвиконанні НДР «Теоретичні основи селекції фундука з використанням молекулярно-генетичних маркерів для ідентифікації видової приналежності вихідних матеріалів і отримуваних гібридів» (номер держреєстрації 0120U103133, 2020-2022 рр.). Об'єкт дослідження – сорти фундука української селекції та види Corylus. Предмет дослідження – ДНК-маркери для характеристики та ідентифікації українських сортів фундука. Мета дослідження – пошук ДНК-маркерів, придатних для генетичного аналізу українських сортів фундука, аналіз їхньої інформативності та використання для генетичної характеристики сортів фундука. Завдання дослідження: 1. Оптимізувати методику виділення та очищення ДНК, придатної для ПЛР-аналізу, з листя ліщини. 2. Визначити інформативність існуючих SSR-маркерів для ідентифікації та диференціації сортів фундука української селекції. 3. Охарактеризувати алельний склад та проаналізувати молекулярну структуру відібраних мікросателітних локусів. 4. Дослідити алельні профілі сортів фундука української селекції з використанням відібраних SSR-маркерів. 5. Провести пошук поліморфних iPBS-маркерів, придатних для молекулярно-генетичної характеристики українських сортів фундука. 6. Визначити інформативність відібраних iPBS-праймерів для ідентифікації та диференціації українських сортів фундука. 7. Порівняти ефективність iPBS-маркерів та SSR-маркерів для диференціації сортів фундука української селекції. Методи дослідження: Виділення ДНК з висушеного листя ліщини за модифікованою ЦТАБ-методикою, мультиплексна ПЛР із флуоресцентно міченими праймерами та фрагментний аналіз SSR-локусів, ПЛР із iPBS-праймерами та електрофорез у агарозному гелі, клонування та сиквенування за Сенгером, біоінформатичні та статистичні методи. Наукова новизна отриманих результатів: Вперше проведено оптимізацію методу виділення та очищення ДНК з ЦТАБ для отримання придатних для ПЛР препаратів ДНК зі зразків висушеного листя ліщини. Вперше охарактеризовано генетичне різноманіття 25 українських сортів фундука за допомогою 9 SSR-локусів та складено індивідуальні алельні профілі для кожного сорту. Визначено інформативність використаних маркерів та мінімальний набір маркерів, достатній для диференціації генотипів у вибірках до 1000 зразків. Визначено структуру використаних мікросателітних локусів у представників роду Corylus, встановлено зв’язок між молекулярною структурою та розміром алелів, виявлено видоспецифічні варіанти деяких мікросателітних локусів. Вперше застосовано iPBS-маркери для диференціації сортів фундука. Показано, що одного з відібраних iPBS-праймерів (2402) достатньо, щоб розрізнити 25 досліджених сортів. Вперше побудовано дендрограми генетичної подібності на основі SSR та iPBS-маркерів для сортів фундука української селекції.