Лахнеко О.Р. Розробка біотехнологічних підходів оцінки пшениці за показниками якості та адаптивності. Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії в галузі знань 16 Хімічна та біоінженерія за спеціальністю 162 Біотехнології та біоінженерія. – Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського», Київ, 2021. Розробка біотехнологічних способів оцінки пшениці за показниками якості білків зерна та адаптивності до дефіциту води є перспективним завданням біотехнології при сучасних реаліях змін клімату та наростаючих питаннях зниження алергенності/токсичності пшениці. Метою роботи є розробка біотехнологічних підходів оцінки пшениці за показниками якості запасних білків зерна та поліморфізму генів адаптивності до посухи. Об’єктом досліджень є біотехнологічні підходи оцінки пшениці за показниками якості запасних білків зерна та адаптивності рослин до посухи. Предметом досліджень є раціональні параметри оцінки пшениці за показниками якості запасних білків зерна та адаптивності до посухи.
В дисертаційній роботі встановлено, що за умов ґрунтової посухи толерантними були сорти озимої пшениці Астарта, Одеська 267 та Подолянка, бо відрізнялися здатністю адаптуватися до несприятливих умов. Виявлено, що зернова продуктивність за дії ґрунтової посухи залежить від регуляції апертури продихів на абаксіальній стороні листка.
Встановлено, що нуклеотидні послідовності гомологічних генів TaWRKY2 з шести контрастних сортів пшениці характеризуються різним рівнем поліморфності: 7 SNP для TaWRKY2-A1, 12 SNP і 1 інсерція для TaWRKY2-B1, 1 делеція для TaWRKY2-D1 з яких 11 призводять до змін в амінокислотному складі поліпептидів; та 3 інсерції, 3 делеції та 20 SNP для промоторного регіону TaWRKY2-D1, з яких 3 SNP потенційно впливають на регуляторні елементи експресії. Виявлено функціональну залежність зміни рівня експресії TaWRKY2 генів від водного режиму вирощування рослин. Два посухочутливі сорти Поліська 90 і Наталка показали швидке і сильне підвищення експресії TaWRKY2 генів у прапорцевому листку – у 5,0 та 4,1 разів відповідно. Серед посухотолерантних сортів лише сорт Одеська 267 показав підвищену експресію TaWRKY2 генів у 1,9 разів, а у колосі серед посухотолерантних сортів лише сорт Подолянка виявив ріст експресії у 1,9 разів.
Виявлено та охарактеризовано 36 SNP, 3 інсерції та 1 делецію в нуклеотидній послідовності гомологічних генів біогенезу продихів пшениці EPF1, EPF2 та MUTE шести контрастних сортів. Проте, лише 15 відмінностей спричиняють зміни в поліпептидному ланцюзі. Досліджено, що гени EPF1, EPF2 та MUTE експресуються на високому рівні лише у молодих листках, які формуються. Розроблено біотехнологічний підхід оцінки пшениці на основі модифікованого методу ПЛР за використанням 9 розроблених відтворюваних систем ДНК-маркерів до генів посухо-опосередкованого транскрипційного фактору TaWRKY2-A1 (PA1), TaWRKY2-B1 (PB1, PB2 та PB3) та TaWRKY2-D1 (PD1, PD2, PD3, PD4 та PD5) та 7 систем до генів біогенезу продихів EPF1-A1 (E1A1), EPF1-B1 (E1B1 та E1B2), EPF1-D1 (E1D1 та E1D2), EPF2-A1 (E2A1) та MUTE-D1 (MD1). Для кожної із систем було підібрано раціональні хімічні умови, температурні та часові режими ПЛР для отримання максимальної кількості бажаних продуктів. Показано на вибірці сортів, диких пшениць та гібридів, що розроблений підхід результативно застосовувати для генотипування, підбору донорів зародкової плазми для схрещувань, дискримінації генетичного матеріалу, що має походження з субгеному D пшениці. Розроблено біотехнологічний підхід оцінки протеомного складу зерна пшениці на основі одноступінчастої екстракції білків і взаємодоповнюючих 2DE-LC/MS та GF-LC/MS, що в комплексі продукували на 20,4% більше білкових ідентифікацій ніж застосування 2DE-LC/MS. Раціоналізоване ферментативне розщеплення диференційно-експресованих білків трьома ферментами при 2DE-LC/MS підході, що дозволило збільшити кількість ідентифікацій з 57,6% до 74,2%. Показано, що більшість диференційно-експресованих білків зерна належать до групи метаболічних протеїнів – 27 білків, 44%; далі гліадини – 20 білків, 33%; а найменше глютенінів – 14 білків, 23%. Найбільше алергенних/токсичних епітопів продемонстрували глютеніни (14 білків, 48%) і гліадини (13 білків, 45%) у порівнянні з неглютеновою групою (2 білки, 7%). Найвищий коефіцієнт накопичення алергенних/токсичних білків був у традиційному сорті Українка (48,7% виявлених білків), що пояснюється генетичною неоднорідністю. На противагу, сучасний сорт Сотниця характеризувався лише 4 з 39 алергенних/токсичних білків (10,3%) і вирізнявся як найбільш підходящий донор зародкової плазми для нових сортів харчового напрямку. Розроблено процесуальні схеми проведення оцінки пшениці за показниками якості білків зерна та адаптивності до посухи. Біотехнологічні підходи проведення оцінки пшениці за показниками якості та адаптивності передбачають одержання фрагментів ДНК та білкових ідентифікацій.
