Дисертаційна робота спрямована на теоретичне обґрунтування та практичне вирішення питань створення вихідного матеріалу пшениці озимої зі стійкістю до борошнистої роси для селекційних цілей та вивчення молекулярно-генетичних основ резистентності рослин до борошнистої роси. Поглиблення теоретичних досліджень і вирішення практичних завдань з метою створення сортів з контрольованим рівнем борошнистої роси є актуальним завданням сучасної науки.
Таким чином, автори виявили стійкість дорослих рослин до борошнистої роси у 86 нових ліній пшениці. Експеримент проводився на випробувальній базі з вирощування пшениці в провінції Хенань в 2020-2022 роках. Тестовані селекційні матеріали були отримані з 45 відповідних селекційних підрозділів Китаю, де були створені 86 нових ліній пшениці. В ході тесту була проведена оцінка стійкості до борошнистої роси, а також аналіз джерел генів резистентності до хвороби. При тестуванні резистентності до борошнистої роси в 2020 році з 86 нових сортів пшениці тільки 11,7 % показали хороші результати. На дорослій стадії розвитку рослин не виявлені лінії зі стійкістю до хвороб, яка була б на рівні імунної або близької до імунізації. Високу стійкість до хвороби на стадії дорослих рослин мали 4 лінії. Ще 2 лінії на цій стадії характеризувалися помірною стійкістю до хвороби. Помірну сприйнятливість мали 4 лінії. Вони становили 4,7 %, 2,3 % та 4,7 % від загальної кількості оцінених зразків відповідно, а вцілому стійкість була низькою.
Нами використаний аналіз родоводу та дані резистентності батьківських форм до хвороб, щоб виявити гени стійкості у досліджуваних сортів. Вірогідно, що генетичними джерелами деяких стійких до борошнистої роси сортів можуть бути Aikang 58, Jimai 22, Yumai 34, Zhengmai 366, Liangxing 66, Zhoumai 16, Zhoumai 18, Yumai 47 та Xiaoyan 926A.
На ранній стадії цього дослідження була сконструйовано колекцію клонів ДНК (кДНК) двогібридних дріжджів (yeast two hybrid - Y2H) з використанням чудового сорту звичайної пшениці Bainong 64, який широко застосовувався у виробництві, а також завершено секвенування геному. Для скринінгу бібліотеки кДНК системи Y2H був використаний як білок-приманка ген Pm46, створений на двохгібридній заквасці. Попередньо було доведено, що стійкість до хвороб може бути пов'язана з функцією отриманих взаємодіючих білкових генів. В результаті цього було клоновано та охарактеризовано TaGDSL, ген, який відіграє позитивну регуляторну роль у стійкості пшениці до борошнистої роси.
Клонування гена Pm46 виконано за участі кДНК сорту Bainong 64 загальною довжиною 1545 пар нуклеотидів, які кодували 514 амінокислот.
За допомогою Y2H виконано скринінг взаємодії білка Pm46. Для конструювання вектора-приманки pGBKT7-Pm46 була використана технологія In-Fusion для введення кодуючої послідовності (CDS) Pm46 в дріжджовий подвійний гібридний вектор-приманку pGBKT7. Зростання дріжджів не мало токсичної дії і не призводило до самоактивації. Це вказує на те, що повна довжина нуклеотидів Pm46 може бути використана як приманка для скринінгу системних бібліотек Y2H. У цьому дослідженні з допомогою Y2H були обстежені 5 білків, що взаємодіють з Pm46 і, можливо, пов'язані з регуляцією захворювань рослин.
Для пригнічення п’яти з відібраних взаємодіючих білкових генів, які можуть бути пов'язані зі стійкістю до хвороб у звичайної пшениці сорту Bainong 207, відповідно була використана система інгібування генів, індукована вірусом смугастої мозаїки ячменю (BSMV-VIGS). Результати показують, що TaGDSL відіграє активну регуляторну роль у механізмі розвитку борошнистої роси.
Були сконструйовані вектор надмірної експресії гена TaGDSL та вектор РНК-інтерференції (RNAi), які методом зараження Agrobacterium перенесено в звичайну пшеницю Bainong 207. Шляхом трансформації Agrobacterium tumefaciens була створена стабільна нокдаун-експресія мічених рослин. Отримані результати підтвердили, що пшениця була більш сприйнятливою до хвороб, коли ген TaGDSL був “вимкнений". Цей результат узгоджується також з аналізами VIGS. Швидкість проростання та росту міцелію борошнистої роси на листках позитивних трансгенних рослин була набагато вищою, ніж у листя пшениці дикого типу (WT).
Підвищену стійкість до борошнистої роси мали рослини з вектором надмірної експресії селективного “мовчання” (RNAi) гена TaGDSL. В результаті аналізу тривалого періоду росту в рослин пшениці показана функціональна ідентифікація гена TaGDSL, в результаті чого “вимкнений" ген TaGDSL може протистояти борошнистій росі. Після інокуляції борошнистою росою урожайність посіву пшениці – біомаса соломи, зерна, кількість колосків і маса 1000 насінин у ліній RNAi були значно вищими, ніж у ліній WT при дозріванні. Цими результатами підтверджуються, що TaGDSL є активним регулятором стійкості до борошнистої роси. Наші висновки демонструють, що “вимкнений" TaGDSL є потенційно корисним, оскільки може допомагати у створенні генетично модифікованих генотипічних матеріалів з резистентністю до борошнистої роси пшениці.
