Тристетрапролін (tristetraprolin, TTP, ZFP36, що кодується геном ZFP36) являє собою РНК-зв’язувальний протеїн (РЗП), що бере участь у посттранскрипційній регуляції експресії шляхом деградації цільових мРНК та вважається одним з ключових регуляторів багатьох клітинних процесів, асоційованих із малігнізацією. Приблизно 15% мРНК мають AU-збагачені елементи (AU-rich repeats, ARE) в їх 3'-нетрансльованих ділянках (3’-НТД) і можуть підлягати регуляції з боку РНК-зв’язувальних протеїнів, одним з яких є ТТР. Показано, що експресія ТТР значно дисрегульована у багатьох типах раку, показано його участь у деградації мРНК, продукти яких асоційовані із міграцією та інвазією, проте на сьогодні даних щодо впливу ТТР та експресію цитоскелет-асоційованих генів недостатньо. Метою роботи було вивчення особливостей впливу надекспресії ТТР на експресію цитоскелет-асоційованих генів SH3PXD2A, SH3PXD2B, CTTN, WIPF1 та WASL в контексті клітинної рухливості та інвазії на моделі тричі-негативного РМЗ, дослідження впливу доксорубіцину на експресію цих генів та клітинну рухливість, а також оцінка можливості використання ТТР як біомаркера в РМЗ.
В даній роботі було in silico проаналізовано 49 транскрипційних варіантів генів, продукти яких залучених до міграції та інвазії, та виявлено, що 24 з них містять у своїх 3’-НТД ARE. Також in silico було проаналізовано ймовірність зв’язування ТТР з мРНК генів цитоскелету SH3PXD2A, SH3PXD2B, CTTN, WIPF1 та WASL та виявлено, що вони із високою ймовірністю зв’язуватимуться з ТТР. Для дослідження впливу ТТР на експресію таргетних генів було створено лінію клітин MDA-MB-231, що відповідає тричі-негативному високоінвазивному субтипу РМЗ (ТНРМЗ), із конститутивною надекспресією ZFP36 та за допомогою кількісної ПЛР в реальному часі виявилено, що надекспресія ZFP36 знижує рівень мРНК SH3PXD2A та CTTN та підвищує рівень мРНК SH3PXD2B.
Подальші дослідження за допомогою конфокальної мікроскопії фіксованих зразків виявили, що модифіковані клітини MDA-MB-231 з надекспресією TTP мали значно меншу площу, більш короткі та широкі актинові філаменти та скупчення актину в кортикальній частині клітин, що в цілому може свідчити про порушення в організації філаментів. Також за допомогою конфокальної мікроскопії живих клітин було виявлено, що модифіковані клітини мали нижчу здатність до переміщення та направлених рухів, а також демонстрували низький інвазивний потенціал. Отримані дані підтримують наявні дослідження та розширюють сьогоднішні уявлення про можливі шляхи прямої або опосередкованої участі ТТР в інгібуванні метастазування.
За допомогою досліджень зразків пухлин РМЗ 5 молекулярних типів виявлено, що рівень експресії ZFP36 був значно вищим у пухлинах усіх типів порівняно із прилеглими тканинами. Також виявлено, що рівень ZFP36 в пухлинах HER2-збагаченого типу значно вищий за такий, що спостерігався у інших типів. Також за допомогою дослідження публічно доступної інформації щодо виживаності пацієнтів у когортах з низькою і високою експресією ZFP36, що надається базою даних GEPIA, виявлено, що середня тривалість життя у когорті пацієнтів із люмінальним В субтипом РМЗ була значно вищою у групі високою експресією ZFP36, тоді як у когорті пацієнтів із HER+ субтипом спостерігалася протилежна кореляція. Отримані в цьому дослідженні дані свідчать про те, що TTP не може бути використаний як суто позитивний прогностичний маркер для пацієнтів з РМЗ, оскільки його високий рівень корелює як із сприятливим, так і з несприятливим прогнозом.
В представленій роботі також показано можливість індукції експресії ZFP36 клінічно релевантними концентраціями доксорубіцину (DXR) (0,1, 0,5 і 1,0 µM). Показано, що DXR індукує експресію ZFP36 за дозо-залежним механізмом, а також дисрегулює експресію таргетних цитоскелет-асоційованих генів. При цьому, у лінії MCF7 максимальний рівень експресії ZFP36 як на рівні мРНК, так і на рівні протеїну був у 2 рази вищий за такий в інтактних клітинах, а в лінії MDA-MB-231 – в 15 разів. Невідомо, чи таке різке і значне підвищення рівня ТТР має місце in vivo, тому необхідні подальші дослідження цього ефекту уже у клінічній площині. Також показано, що DXR знижує рухливість клітин лінії MDA-MB-231 за дозо-залежним механізмом та призводить до значних змін в їх площі, формі та організації актинових філаментів. Отримані результати дозволяють поставити під сумнів використання ТТР як виключно позитивного прогностичного маркера для пацієнтів із РМЗ принаймні із ТНРМЗ та розширюють сучасні уявлення щодо впливу доксорубіцину на цитоскелет.
Представлені результати розширюють уявлення про вплив ТТР на інвазивний потенціал клітин ТНРМЗ, розкривають нові потенційні аспекти його функціонування як регулятора морфології та рухливості цих клітин, характеризують зміни експресії SH3PXD2A, SH3PXD2В та CTTN під впливом конститутивної надекспресії ТТР в клітинах ТНРМЗ, а також під впливом DXR. Крім того, дане дослідження виявляє спірність застосування ТТР як суто позитивного прогностичного біомаркеру РМЗ.
