Ржепецький Ю. А. Фосфорилювання адаптерного протеїну ruk/CIN85 в регуляції біологічних відповідей клітин

Об'єкт дослідження: Молекулярні механізми функціонування адаптерних/риштувальних протеїнів. Мета роботи: дослідити можливість фосфорилювання адаптерного протеїну Ruk/CIN85 in cellulo та зміни в рівні посттрансляційної модифікації при дії поліпептидних факторів росту, ідентифікувати Ser/Thr-специфічні протеїнкінази, що утворюють комплекси з адаптерним протеїном, з'ясувати механізми та роль виявленої міжмолекулярної взаємодії. Методи дослідження: методи біохімії, молекулярної та клітинної біології. Проведено комплекс експериментальних робіт, які безпосередньо доводять явище посттрансляційної модифікації адаптерного протеїну Ruk/CIN85 in cellulo шляхом фосфорилювання та зміни у рівні фосфорилювання в процесі реалізації біологічних відповідей клітин. Показано, що Ruk/CIN85 утворює комплекси з протеїнкіназами, здатними модифікувати адаптерний протеїн. Вперше встановлено, що PKD є зв'язувальним партнером Ruk/CIN85, досліджено механізми міжмолекулярної взаємодії та ідентифіковано локалізацію сайтів фосфорилювання. Результати проведених досліджень свідчать про функціональну роль взаємодії Ruk/CIN85-PKD у регулюванні процесів міграції й інвазії пухлинних клітин. З використанням метаболічного мічення Т-лімфомних клітин лінії Jurkat 32Р-фосфатом з наступною імунопреципітацією вперше показано, що адаптерний протеїн Ruk/CIN85 зазнає фосфорилюванню in cellulo. Вперше встановлено, що повнорозмірна (Rukl) та середня (Rukm) ізоформи Ruk утворюють комплекси з протеїнкіназами в клітинах НЕК293, здатними диференційно фосфорилювати адаптерний протеїн, причому рівень фосфорилювання різноскеровано змінюється при стимуляції клітин ембріональною сироваткою корови та інсуліном. На моделі клітин феохромоцитоми щура лінії РС12 продемонстровано особливості фосфорилювання повнорозмірної і середньої ізоформ Ruk/CIN85 по залишках тирозину, серину і треоніну при індукції диференціювання та проліферації за допомогою NGF та EGF, відповідно. Вперше Ser/Thr-срецифічна PKD ідентифікована як зв'язувальний партнер Ruk/CIN85, з'ясовано механізми міжмолекулярної взаємодії та ідентифіковано сайти адаптерного протеїну, що зазнають модифікації за участі PKD2. Встановлено пригнічення взаємодії Ruk/CIN85 з PKD2 при стимуляції В-клітинного рецептора в В-лімфоцитах, ізольованих з мигдаликів людини, та клітинах лімфоми Беркета Ramos. За допомогою конфокальної мікроскопії показано співлокалізацію Ruk/CIN85 та PKD2 в ділянках ламеліподій та мембранних складок в аденокарциномних клітинах грудної залози людини лінії MCF-7, стабільно трансфікованих Rukl/CIN85-GFP. Продемонстровано посилення міграційного потенціалу клітин MCF-7 зі стабільною надекспресією Rukl/CIN85-GFP та утворення комплексу Ruk/CIN85 з актин-зв'язувальним протеїном кортактином у цих клітинах. Сфери використання: клітинна біологія, молекулярна біологія.