Секан А. С. Використання сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP для одноетапного отримання трансформантів Arabidopsis thaliana, вільних від маркерних послідовностей

Об'єкт дослідження: ефективність роботи сайт-специфічної системи Cre/loxP в геномі трансформованих ліній A.thaliana в межах створених векторних ДНК-конструкцій протягом трьох поколінь трансформантів. Предмет дослідження: одноетапне отримання трансформантів A.thaliana, за допомогою нового підходу з використання сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP, що має на меті повне видалення маркерных генов разом з геном cre, без залучення тканино-специфічних чи індуцибельних промоторів. Розроблено та сконструйовано два типи ДНК-конструкцій із сайт-специфічною рекомбіназною системою Cre/loxP (Cre/loxP1 та Cre/loxP2) з метою визначення вдалішого дизайну для отримання трансгенних рослин A. thaliana, вільних від loxP-обмежених ділянок Т-ДНК. За допомогою методу агробактеріальної трансформації шляхом занурення квіток з використанням створених ДНК-конструкцій одноетапно отримано генетично модифіковані лінії рослин A. thaliana (покоління Т0). Розроблено ефективну систему селекції трансгенних ліній рослин в присутності сайт-специфічної рекомбінази Cre/loxP в їх геномі та отримано два наступних покоління трансгенних ліній (покоління Т1 та Т2). Проведено гістохімічний та молекулярно-генетичний аналіз кожного з поколінь трансформантів для ідентифікації події видалення loxP-обмежених ділянок Т-ДНК з маркерними генами. Виявлено, що за допомогою розробленого підходу із застосування сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP вдається отримати трансформанти, вільні від маркерних генів вже у першому поколінні: у 10% рослин, трансформованих з використанням конструкції Cre/loxP1, та в 12% - з використанням конструкції Cre/loxP2. Показано, що з кожним наступним поколінням кількість ліній, трансформованих тією чи іншою ДНК-конструкцією та вільних від маркерних послідовностей зростає на 5-7%. Встановлено, що ефективність використання розробленого підходу із застосуванням сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP для отримання генетично модифікованих рослин A. thaliana, вільних від послідовностей ДНК з маркерними генами, для векторної конструкції Cre/loxP1 становить 53% та для Cre/loxP2 - 43%. Проведено статистичний аналіз прояву ефектів при використанні обох досліджуваних видів ДНК-конструкцій і показано, що зміна розташування генів у векторних касетах обумовлює виникнення різних генетичних подій, в результаті чого було отримано трансгенні рослини з різними інтегрованими Т-ДНК. Розроблено статистичну класифікаційну модель, за допомогою котрої вдалось виділити критичні етапи експериментальних досліджень ефективності роботи розроблених ДНК-конструкцій, що уможливлює спрогнозувати ефективність використання розроблених ДНК-конструкцій на інших рослинних об'єктах з можливістю передбачення результатів прояву Т-ДНК в майбутніх трансформантах на 60%.