Федорчук В. В. Використання інгібіторів протеїнкіназ та протеїнфосфатаз для підвищення ефективності методу трансформації рослин за допомогою Agrobacterium tumefaciens

У роботі представлено результати проведених досліджень впливу інгібіторів протеїнкіназ (трифлюоперазину, геністеїну, W7) та протеїнфосфатаз (отованадату натрію, кантаридину) на підвищення ефективності методу трансформації тютюну (N. tabacum) за допомогою A. tumefaciens. Досліджено широкий діапазон концентрацій інгібітору Са2+ - кальмодулін залежної протеїнкінази трифлюоперазина (10-300 мкМ) та встановлено, що найбільш ефективного підвищення частоти Agrobacterium-опосередкованої трансформації листкових експлантів тютюну вдається досягти за умов його використання в концентраціях 10 та 25 мкМ (24-25%, відповідно). Проаналізовано вплив інгібітору Са2+-кальмодулін-залежної протеїнкінази W7 в концентраціях від 25 до 100 мкМ і виявлено, що не дивлячись на відсутність впливу на частоту генетичної трансформації його використання у концентрації 25 мкМ призводило до значного підвищення ефективності регенерації та швидкості росту рослин-регенерантів у порівнянні з контролем. Вивчено вплив інгібітору тирозинкіназ геністеїну в концентраціях від 10 до 100 мкМ на підвищення частоти Agrobacterium-опосередкованої трансформації листкових експлантів тютюну і встановлено, що найбільш ефективною концентрацією, яка виявляла позитивний ефект, була концентрація 100 мкМ (зростання частоти трансформації на 5-10% в залежності від тривалості ко-культивування). Досліджено вплив ортованадату натрію, інгібітору тирозинфосфатаз, у діапазоні концентрацій від 10 до 250 мкМ на частоту Agrobacterium-опосередкованої трансформації та встановлено, що при ко-культивуванні експлантів у присутності цього інгібітору протягом 48 год (200 та 250 мкМ) частота трансформації підвищувалась на 30 та 40%, відповідно. Перевірено вплив різних концентрацій інгібітору серин/треонінових протеїнфосфатаз кантаридину (0,1-1 мкМ) на частоту Agrobacterium-опосередкованої трансформації листкових дисків тютюну і встановлено, що в залежності від тривалості ко-культивування з цим інгібітором частота трансформації підвищувалась на 4-11%. За допомогою молекулярно-генетичного аналізу (ПЛР) підтверджено трансгенну природу ліній тютюну, отриманих шляхом Agrobacterium-опосередкованої трансформації при використанні усіх досліджуваних інгібіторів. Встановлено, що результати транзієнтної трансформації (аналіз експресії репортерного гена gus) співпадають з результатами стабільної трансформації. Отримані дані свідчать на користь того, що у регуляції Agrobacterium-опосередкованого переносу генів та їх інтеграції в рослинний геном важлива роль належить процесам фосфорилювання та дефосфорилювання білків, які знаходяться під контролем різних внутрішньоклітинних сигнальних систем.