Мазанова А. О. Розробка імуноензимної тест-системи для визначення 25OHD як маркера забезпеченості організму вітаміном D за цукрового діабету

Дисертація присвячена розробці імуноензимного діагностикуму для визначення рівня 25OHD у сироватці крові з метою характеристики вітамін D-статусу організму за низки патологічних станів, зокрема цукрового діабету 1 типу. Для генерування поліклональних антитіл в організмі кролів було синтезовано кон’югат 25OHD3 з гемоціаніном молюска (KLH) за допомогою модифікованого карбодиімідного методу. Кон’югати було охарактеризовано методами гель-фільтрації та тонкошарової хроматографії. Після імунізування, у сироватці крові кролів було визначено титр специфічних антитіл до 25OHD, що становив 1:10000. З метою концентрування антитіл проводили їх ви¬солювання за допомогою сульфату амонію ((NH4)2SO4). Для конструювання імунодіагностикуму проводили підбір концентрації конкуруючого агента – 25OHD3-LC-біотину, яка становила 5 нг/мл. Валідування створеної тест-системи проводили за низкою характеристик: було побудовано стандартну калібрувальну криву у діапазоні концентрацій калібраторів 25OHD3 0-150 нг/мл; визначено ліміт детектування (2,3 нг/мл) та кількісний ліміт (6,9 нг/мл); показано відсутність «матричного» ефекту гемоглобіну, білірубіну та триацилгліцеролів на проведення аналізу; визначено Intra CV та Inter CV, що лежать у межах допустимих 10%; продемонстровано, що перехресна реактивність системи з іншими метаболітами вітаміну D не перевищував 10%. Отже, створений діагностикум може бути використаний для визначення 25OHD у серологічних зразках. Показано, що розвиток експериментального цукрового діабету 1 типу супроводжується значним зниженням вмісту 25OHD у сироватці крові тварин, що призводить до порушення синтезу ключових елементів вітамін D-ендокринної системи у нирках, печінці, кістковій тканині та кістковому мозку. Відновлення забезпеченості організму експериментальних тварин вітаміном D сприяє корегуванню порушень обміну вітаміну D та VDR-опосередкованого клітинного сигналювання за участю 1α,25(OH)2D.