Об'єкт дослідження. Підвищення стійкості рослин до фітопатогенних організмів шляхом індукції процесів РНК-інтерференції новими полікомпонентними регуляторами росту природного походження, а також за допомогою генетично-інженерних методів. Предмет дослідження. Особливості стимулюючої дії регуляторів росту на генетичні маркери підвищення стійкості рослин до фітопатогенних організмів: зміни популяційних характеристик цитоплазматичних мРНК і малих регуляторних si/miРНК, підвищення функціональної (трансляційної) активності мРНК та сайленсингової (інгібуючої) активності si/miРНК у безклітинних системах білкового синтезу з проростків пшениці, а також зміни спектру білків, синтезованих в умовах in vivo та in vitro. Методи дослідження. У дослідженнях використовували методи культивування трансгенних коренів цикорію в умовах in vitro, біохімічні методи аналізу загального білку та поліфруктанів, ентомологічні методи визначення чисельності шкідників рослин та антинематодної активності полікомпонентних регуляторів природного та мікробіологічного походження в умовах in vitro та in vivo, морфо-фізіологічні методи для вивчення впливу регуляторів на проростання насіння та розвиток рослин, молекулярно-біологічні методи: виділення сумарних ДНК та РНК, метод хроматографії на оліго(dT)-целюлозних колонках, метод радіоавтографії, метод визначення радіоактивності проб у сцинтиляційному лічильнику, метод фракціонування мРНП- та рРНП-часток у градієнті щільності CsCl, метод виділення цитоплазматичних малих регуляторних si/miРНК, одномірний та двомірний ПААГ-електрофорез, методи дослідження функціональної (трансляційної) активності мРНК та сайленсингової активності si/miРНК у безклітинних системах білкового синтезу з проростків пшениці, ПЛР-ампліфікація, ЗТ-ПЛР-ампліфікація, клонування ампліфікованих фрагментів ДНК у плазмідний вектор, метод флоральної генетичної трансформації, методи Дот-блот та Нозерн-блот гібридизації. Представлено результати досліджень щодо можливості підвищення стійкості рослин до фітопатогенних організмів шляхом індукції процесів РНК-інтерференції з використанням полікомпонентних регуляторів росту природного походження і методів генетичної інженерії, а також з'ясовано генетичні та епігенетичні механізми покращення цих ознак у рослин. За допомогою молекулярно-біологічних методів встановлено, що прискорююча проростання насіння квасолі дія регуляторів росту Івіну та Радостиму опосередковується шляхом активації ними біосинтезу мРНК, рРНК і білків. Методом Дот-блоттингу встановлено суттєву різницю у ступеню гомології (до 22 %) між популяціями мРНК з клітин зародкової осі насіння квасолі, необробленого та обробленого регуляторами Емістимом та Аверкомом. Встановлено вплив регуляторів росту Емістиму С, Радостиму, Агростимуліну, Зеастимуліну, Біолану на підвищення біосинтезу білків у клітинах 5-ти денних проростків рослин квасолі, гороху, сої, ячменю, пшениці, кукурудзи, а також у безклітинній системі з проростків пшениці на матрицях полі(А)+РНК з клітин цих проростків. Виявлено вплив регулятору Емістиму С на підвищення фотосинтетичної активності клітин листків рослин сої, гороху, пшениці та кукурудзи у різні періоди доби та на посилення різниць у ступеню гомології (до 13 %) між популяціями мРНК контрольних та дослідних рослин. Встановлено стимулюючу дію регуляторів росту Івіну, Емістиму, Біолану та Чаркору на підвищення приросту біомаси (від 10,0 - до 54 разів) та загального вмісту поліфруктанів (від 7,0 - до 35 разів на одиницю загальної маси коренів) у культурах "бородатих коренів" цикорію. У польових та тепличних дослідженнях встановлено підвищення стійкості ряду сільськогосподарських культур до шкідників та патогенних організмів при обробці насіння та обприскування посівів рослин регуляторами росту: Регоплантом (до 98 %), Стімпо (до 89 %) та Радостимом (до 74 %), які сприяли збереженню врожаю більш ніж на 80 % відносно контролю. За допомогою Дот-блоттингу мРНК з si/miРНК та вивченням сайленсингової активності si/miРНК в безклітинній системі білкового синтезу вперше показано, що стійкість рослин цукрового буряка до нематод H. schachtii та M. incognita досягається шляхом стимуляції регуляторами синтезу у клітинах рослин антинематодних si/miРНК. Встановлено значні різниці (до 6-23 %) у ступеню гомології між мРНК контрольних та si/miРНК дослідних рослин пшениці, огірків, картоплі, інфікованих патогенним мікроміцетом F. oxysporum і паразитичними нематодами M. іncognita та D. destructor і оброблених регулятором росту Аверкомом та його похідними; у безклітинній системі з проростків пшениці виявлено вплив цих регуляторів на підвищення сайленсингової активності si/miРНК. Шляхом опосередкованої A. tumefaciens генетичної трансформації сконструйованим вектором експресії dsРНК, специфічних до консервативної ділянки гена 8Н07 коренепаразитуючої нематоди H. schachtii, отримано рослини ріпаку з підвищеною стійкістю до цієї нематоди. Нозерн-блот аналізом підтверджено наявність у геномі рослин ріпаку кДНК-фрагменту експресіїї антинематодних dsРНК, а також встановлено їх високу сайленсингову активність в організмі нематод і у інфікованих ними рослин. Ключові слова: полікомпонентні регулятори росту з біозахисною активністю, синтез білків in vivo та у безклітинній системі in vitro, стійкість рослин до паразитичних нематод та патогенних мікроміцетів, антинематодні та антипатогенні si/miРНК, Дот-блот гібридизація між популяціями мРНК та si/miРНК, сайленсингова активність si/miРНК, вектор експресії антинематодних dsРНК, трансгенні РНК-інтерферовані рослини ріпаку. Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано можливість підвищення стійкості рослин до фітопатогенних організмів шляхом індукції процесів РНК-інтерференції новими полікомпонентними регуляторами росту та за допомогою методів генетичної інженерії. Вперше за допомогою дот-блот гібридизації встановлено значні відмінності ступеню гомології цитоплазматичних мРНК, виділених з клітин зародкової осі насіння квасолі, обробленого регуляторами росту природного та мікробіологічного походження, а також виявлено підвищення функціональної (трансляційної) активності мРНК у безклітинній системі білкового синтезу in vitro. Вперше виявлено вплив регулятору росту Емістим С на підвищення фотосинтетичної активності рослин за умов різної інтенсивності освітлення. Встановлено, що регулятори росту Івін, Емістим, Біолан та Чаркор стимулюють приріст біомаси (в 10-54 рази) та підвищують загальний вміст поліфруктанів (від 7 до 35 разів) у культурах клітин "бородатих коренів" цикорію in vitro, що може вказувати на зміну регуляторами експресії генів фітогормонів, які контролюють ріст коренів та синтез у них цих полісахаридів. Вперше встановлено суттєву різницю між популяціями мРНК та si/miРНК контрольних та оброблених регуляторами росту Біолан, Регоплант та Стімпо проростків цукрового буряку та пшениці, що вирощувались у відсутності патогенних організмів та на штучно створеному нематодами Нeterodera schachtii та Meloidogyne incognita, а також мікроміцетом Fusarium oxysporum інфекційних фонах. Вперше виявлено гетерозис-подібний ефект стійкості до патогенних мікроміцетів роду Fusarium L. у другому поколінні рослин пшениці та нуту, отриманих з насіння рослин, що протягом онтогенезу в першому поколінні вирощувались на інфекційному фоні та оброблялись регуляторами росту Біолан, Регоплант та Стімпо. За допомогою дот-блот гібридизації встановлено значні відмінності ступеню гомології між si/miРНК, ізольованих з клітин оброблених регуляторами та мРНК з клітин контрольних рослин. Вперше показано, що полікомпонентний регулятор росту природного походження Регоплант індукує підвищення стійкості рослин каштанів до каштанової мінуючої молі шляхом стимуляції синтезу si/miРНК із захисними властивостями від цього шкідника. Встановлено суттєву різницю ступеню гомології (6-23%) між мРНК та si/miРНК, ізольованих з клітин контрольних та рослин пшениці, огірків і картоплі, вирощених на фоні інфікування патогенними грибами та паразитичними нематодами і оброблених регулятором росту мікробіологічного походження Аверком та його похідними. У безклітинній системі білкового синтезу з проростків пшениці встановлено значне підвищення сайленсингової активності (до 58-65%) si/miРНК з клітин дослідних рослин, оброблених регулятором росту мікробіологічного походження Аверком та його похідними, порівняно з si/miРНК контрольних рослин (до 20%). Вперше встановлено, що регулятор росту природного походження Регоплант значно підвищує в клітинах уражених нематодою Н. schachtii рослин синтез малих регуляторних si/miРНК, що мають високу ступінь гомології до фрагменту кДНК консервативної ділянки гену 8H07 цієї нематоди. Вперше за допомогою A. tumefaciens-опосередкованої генетичної трансформації одержано стійкі до нематоди H. schachtii трансгенні рослини ріпаку з вектором конститутивної експресії dsРНК, антисенсових до консервативної ділянки гена 8Н07 нематоди H. schachtii. Ступінь упровадження: Розроблено та апробовано технологію підвищення новими полікомпонентними регуляторами росту рослин Регоплант та Стімпо продуктивності та стійкості сільськогосподарських культур: озимої та ярої пшениці, ячменю, сої та кукурудзи до шкідників: хлібного туруна (Zabrus tenebrioides), озимої совки (Scotia segetum), злакових мух (Cloropidae spp.), пшеничної нематоди (Anguina tritici) та фітопатогенних грибів як Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Trichothecium roseum. Удосконалено технологію підвищення синтезу запасних сполук - поліфруктанів (до 54 разів) у культурах "бородатих коренів" цикорію шляхом додавання до живильного середовища ? MC нових полікомпонентних регуляторів росту природного (Емістим, Біолан, Чаркор) та синтетичного (Івін) походження. Розроблений метод може використовуватись у біотехнологічній практиці для культивування "бородатих коренів" лікарської рослини цикорію для отримання суперсинтезу поліфруктанів, які можуть застосовуватись у харчовій, медичній та фармацевтичній галузях. Запропоновано новий підхід підвищення стійкості рослин ріпаку до фітонематоди H. schachtii за допомогою використання генетично-інженерної технології РНК-інтерференції, яка може застосовуватись у якості альтернативної екологічно безпечної стратегії контролю розповсюдження цього шкідника та зниження спроможності ураження ним важливих для сільського господарства біоенергетичних культур ріпаку. Сфера використання: біотехнологічна галузь
