ЗУО М. .. Регуляція деградації β-галактозидази та метаболічна інженерія ферментації ксилози у метилотрофних дріжджів Komаgataella phaffii та Ogataea polymorpha

Дисертація головним чином зосереджена на трьох розділах: перший передбачає виділення мутантів з дефектами цитозольної деградації β-галактозидази у метилотрофних дріжджів Komagataella phaffii за допомогою хімічного мутагену N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідину (MNNG); метою другого є розробка нових домінантних селективних маркерів для застосування у майбутньому в метаболічній інженерії дріжджів O. polymorpha; третій стосується розробки та впровадження стратегій метаболічної інженерії для отримання штамів Ogataea polymorpha з підвищеною ефективністю продукції етанолу з ксилози. Komagataella phaffii (раніше відомі як Pichia pastoris) є облігатними аеробними метилотрофними дріжджами, здатними використовувати метанол як єдине джерело вуглецю та енергії (Mastropietro et al., 2021). Їх властивості, такі як здатність до респіраторного росту до дуже високої концентрації клітин, ефективна секреція білка та стабільна експресія рекомбінантних білків, контрольована сильними індуцибельними промоторами, роблять K. phaffii дуже цінними у фармацевтичному та біотехнологічному секторах. У цій дисертації хімічний мутаген N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідин (MNNG) був використаний для відбору нових мутантних штамів, що демонструють порушення деградації β-галактозидази. Порушення деградації цього ферменту у вибраних мутантів оцінювали на основі їх синього кольору на чашках із YPD з X-gal після зміни метанолу на глюкозу у якості ростового субстрату. Було ідентифіковано чотири мутанти, що демонструють підвищену активність β-галактозидази на глюкозі порівняно з батьківським штамом. Крапельний тест та визначення концентрації флоксину B, проведені в умовах голодування за Нітрогеном, виявили дефекти росту цих мутантів. Крім того, біомаса мутантних штамів була значно меншою порівняно з батьківським штамом. Ці дані свідчать про те, що вибрані мутанти мають дефекти автофагії. Також, щоб дослідити пексофагію, у відібраних мутантах після переведення клітин з метанолу на глюкозу вимірювали залишкову активність ключового протеїну матриксу пероксисоми – алкогольоксидази (AOX). Результати продемонстрували, що мутанти MNNG-1 і MNNG-3 мають дефекти як селективної аутофагії, так і пексофагії, тоді як мутанти MNNG-2 і MNNG-4 характеризувалися виключно дефектами селективної аутофагії цитозольної β-галактозидази. Таким чином, це дослідження створює основу для подальшого вивчення автофагії та деградарції білків, прокладаючи шлях до прогресу в біотехнології та фармації, де точний контроль автофагічних процесів є важливим. Таким чином, у цій роботі, ми оцінили два потенційні домінантні маркери для O. polymorpha: мутований ген AUR1 та нативний ген IMH3, що забезпечують стійкість до авреобазидину та мікофенолової кислоти, відповідно. Ці маркери були протестовані для їх потенційного використання у метаболічній інженерії O. polymorpha. Дві мутантні версії гену AUR1 було створено для розробки штамів O. polymorpha, стійких до авреобазидину. В третьому розділі цієї дисертації ми в основному зосереджуємося на підвищеній продукції біоетанолу з ксилози в O. polymorpha. Таким чином, ця дисертація зосереджена на дослідженні ролі гена гексозного сенсора HXS1 та гена AZF1, який кодує гомолог транскрипційного фактора з S. cerevisiae із сенсорними властивостями, у спиртовому бродінні ксилози та глюкози O. polymorpha. Дані свідчать про те, що надекспресія генів AZF1 і HXS1 позитивно впливає на виробництво етанолу з ксилози в штамах O. polymorpha. Враховуючи, що ефективне бродіння ксилози має важливе значення для оптимізації виробництва біоетанолу з лігноцелюлозної біомаси, розуміння цих механізмів є необхідним для вдосконалення промислового застосування та підвищення економічної ефективності біопалива. Крім того, штами, розроблені в цьому дослідженні, можуть бути використані для створення стабільних надрпродуцентів етанолу.