Дисертаційна робота присвячена розробці підходів до посилення імуногенності рекомбінантних плазмідних конструкцій, які містять химерний ген Е2 глікопротеїна віруса класичної чуми свиней, шляхом оптимізації складу модельної маркованої ДНК-вакцини. В ході виконання роботи було створено серію рекомбінантних плазмід, які містять химерні гени на основі SacI-EcoRI фрагменту Е2 віруса класичної чуми свиней під транскрипційним контролем промотору/енхансеру ранніх генів цитомегаловірусу людини у складі евкаріотичної еспресійної касети, що розташована між інвертованими термінальними повторами адено-асоційованого вірусу -2 людини (ITR AAV-2). В транзиторній системі експресії показано, що введення до складу рекомбінатного вектору послідовностей ITR AAV-2 призводить до збільшення накопичення химерного антигену на основі Е2 ВКЧС в трансфікованих клітинах лінії НЕК293. Так для клітин лінії НЕК293, які були трансфіковані pTR-EGFP/E2 на третю добу після трансфекції показано експресію химерного EGFP/E2 на рівні ~ 113 ± 21 нг/105 кл/72 год, в той час як для клітин, трансфікованих плазмідою pEGFP/E2 - ~ 15 ± 3.7 нг/105 кл/72 год. Варто зауважити, що різниця рівнів експресії химерного білка EGFP/E2, що спостерігалася при трансфекції клітин лінії НЕК293 плазмідами pTR-EGFP/E2 та pEGFP-E2, не була наслідком пригнічення метаболічної активності клітин за рахунок більшої цитотоксичності препаратів ДНК/ПЕІ, чи цитотоксичного впливу експресії химерного протеїну. Продемонстровано, що введення ITR AAV-2 у плазмідний вектор не впливало суттєво на тривалість експресії та персистенції трансгену у клітинах НЕК293 за умови відсутності селективного тиску. Виявлено, що створені рекомбінантні плазмідні конструкції pTR-BKneo- та pBS-BK здатні індукувати продукцію специфічних до фрагменту Е2 ВКЧС антитіл у мишей. Вперше продемонстровано, що введення до складу векторної конструкції модельної маркованої ДНК-вакцини проти КЧС послідовностей ITR AAV-2 призводить до збільшення як інтенсивності, так і тривалості гуморальної імунної відповіді на імунізацію.
Відомо, що застосування гетерологічної бустерної вакцинації може значно посилити імуногенність кандидатних вакцинних препаратів, а також дозволить знизити їх реактогенність та ймовірність розвитку імунної відповіді на вектор. Отримані нами дані свідчать по те, що бустерна імунізація фрагментом рекомбінантного білку Е2 ВКЧС після дворазової імунізації плазмідним вектором pTR-BKneo- призводить до значного посилення синтезу антитіл до цільового антигену порівняно з триразовим введенням pTR-BKneo-.
Однією з перспективних стратегій посилення імунної відповіді на ДНК-вакцинацію, яка розглядається останнім часом, є введення до складу вакцинного препарату так званих «генних ад’ювантів» - рекомбінантних векторів, які несуть гени цитокінів, хемокінів чи ко-стимуляторних молекул.
В рамках цієї роботи ми створили рекомбінантні конструкції pmIL12-TR та pmIL2-TR, які містять гени інтерлейкіну-12 та інтерлейкіну-2 миші відповідно, під транскрипційним контролем промотору/енхансеру ранніх генів цитомегаловірусу людини у складі експресійної касети розташованої між ІТR ААV-2. А також їх похідні pTR-mIL2/EGFP та pTR-mIL2/EGFP, які містять ген химерного білка IL2/EGFP та IL12/EGFP відповідно. Дослідження функціональної активності створених векторів in vitro продемонструвало, що химерні білки експресуються зі створених рекомбінантних конструкцій у клітинах лінії НЕК293, та частково секретуються з клітин у культиваційне середовище. В дослідах in vivo було доведено, що комбіноване введення pTR-BKneo- та генів інтерлейкіну-2 та химерного інтерлейкіну-12 миші у складі створених рекомбінантних конструкцій посилює гуморальну імунну відповідь на Е2 ВКЧС. Показано, що ефект посилення найбільш виражений у групі тварин, якім вводили по 10 мкг pmIL12-TR та pmIL2-TR у комбінації з pTR-BKneo-.
