Одним з основних пріоритетів сьогодення є розробка ефективної технології отримання альтернативних джерел енергії. До складу гідролізатів лігноцелюлози входять два основні цукри: глюкоза, яка зброджується в першу чергу, та ксилоза. Ідентифікація нових генів, які можуть бути мішенями у регуляції алкогольної ферментації ксилози з метою подальшої їх інженерії є актуальним завданням. За допомогою флуориметричного та флуоресцентного аналізів показано, що пероксисоми Saccharomyces cerevisiae довше зберігалися під час ферментації ксилози ніж на глюкозі. З метою дослідження ролі не окремих пероксисомних ферментів а цілих цих органел здійснено делецію гена PEX3, що кодує пероксисомний мембранний білок. Вперше було показано, що дефіцит пероксисом призводить до зниження накопичення етанолу з ксилози штамом pex3Δ в 1,5 раза порівняно з вихідним штамом.
Досліджено рівень АФК в клітинах штаму GS010 під час ферментації глюкози та ксилози, та показано що катаболізм ксилози супряжений з генерацією підвищеної кількості АФК. При ферментації саме ксилози зафіксовано у 1,7-1,8 раза вищий рівень АФК. Вперше встановлено роль пероксисомної каталази Cta1 в процесі алкогольної ферментації ксилози у рекомбінантного штаму S. cerevisiae. Делеція гена CTA1 призводила до обмеження приросту біомаси та зниження продукції етанолу в 2 рази при порівнянні з вихідним штамом. За рахунок активності цитозольної ізоформи активність каталази у штамі cta1∆ була у 6 разів нижчою порівняно з реципієнтним штамом. Встановлено, що посилення експресії гена PEX34, що кодує пероксисомний інтегральний мембранний білок, приводить до формування пероксисом більшого розміру та підвищує в 1,4 раза продукцію етанолу з ксилози за умов алкогольної ферментації.
Під час виконання даної роботи на основі ксилозо-ферментуючого штаму S. cerevisiae сконструйовано колекцію штамів з делецією та посиленою експресією низки генів ADR1, CAT8, ASG1, HAP4, SIP4, TUP1 та ZNF1, що кодують транскрипційні фактори та досліджено їх вплив на алкогольну ферментацю ксилози. Транскрипційний фактор Znf1 S. cerevisiae належить до родини транскрипційних активаторів цинкового кластеру та зв’язується з промоторами генів, продукти яких беруть участь у клітинному диханні, глюконеогенезі, циклі трикарбонових кислот та гліоксилатному шунті. Встановлено, що Znf1 не впливає на алкогольну ферментацію ксилози у S. cerevisiae, оскільки, як делеція так і посилення експресії ZNF1 не змінювали рівень продукції етанолу при ферментації цієї пентози. Транскрипційний фактор цинкового кластеру Sip4, який є субстратом протеїнкінази Snf1, взаємодіє з CSREs (cell type-specific regulatory elements) елементами і є активатором генів, що кодують ферменти глюконеогенезу. Продукція етанолу надекспресуючим штамом SIP4 була знижена більш ніж вдвічі, порівняно з батьківським, і становила 2,8 г/л. Транскрипційні регулятори Adr1 та Cat8 залежать від Snf1-опосередкованої індукції та здійснюють дерепресію низки генів, залучених у глюконеогенез та β-окислення. Встановлено, що як делеція так і посилена експресія ADR1 призводили до зниження продукції етанолу з ксилози, що становила 4,3 г/л для adr1Δ та 4,25 г/л для ADR1, тоді як вихідний штам GS010 продукував 5,85 г/л етанолу. Одержаний мутант cat8Δ демонстрував підвищення продукції етанолу з ксилози на 9,5% порівняно із батьківським штамом. Посилення експресії CAT8 напроти, призвело до зниження продукції етанолу на 7,3% порівняно з вихідним штамом GS010. Транскрипційний фактор Asg1 теж належить до родини цинкового кластеру та є регулятором генів кількох метаболічних шляхів: β-окислення, гліоксилатного циклу, глюконеогенезу, та імпорту довго-ланцюгових жирних кислот до пероксисом. Делеція ASG1 у штамі GS010 призвела до зниження продукції етанолу з ксилози у 1,23 раза. Tup1 - загальний репресор транскрипції, утворює комплекс з Cyc8, бере участь у створенні репресивної структури хроматину через взаємодію з гістонами Н3 та Н4. При ферментації ксилози штамом tup1Δ продукція етанолу була нижчою в 1,58 раза. Продукція етанолу з глюкози була нижчою в 1,26 раза.
У S. cerevisiae ідентифіковано транскрипційний активатор Hap4, що відіграє ключову роль у контролі експресії генів мітохондріального дихання. Виявлено, що делеція HAP4 суттєво поліпшує продукцію етанолу при ферментації ксилози. Мутант продукує 10,4 г/л етанолу, при цьому вихід етанолу сягає 0,414 г/г ксилози. Натомість посилення експресії HAP4 призводило до зниження продукції етанолу при ферментації ксилози.
У результаті роботи ідентифіковано нові мішені для створення продуцентів паливного етанолу на основі ксилозо-ферментуючих штамів дріжджів S. cerevisiae. Застосовані у роботі генно-інженерні підходи можуть бути екстрапольовані на інші перспективні дріжджові продуценти паливного етанолу. Сконструйовані штами можуть слугувати основою для подальших генно-інженерних маніпуляцій.
