Метою дисертаційного дослідження було отримання біотехнологічних рослин комерційної лінії озимого ріпаку B. napus L. української селекції, а також створення платформи для редагування геному озимого ріпаку з використанням системи CRISPR/Cas9 та прийомів генетичної інженерії.
У роботі використано такі методи досліджень: аналіз наукової літератури; лабораторні методи (культивування тканин рослин in vitro, Agrobacterium-опосередкована генетична трансформація, полімеразна ланцюгова реакція, імуноферментний аналіз, гістохімічний метод визначення активності гена β-глюкуронідази, метод молекулярного клонування Golden Gate); біоінформаційні (комп'ютерне моделювання in silico генетичних векторів), фізіологічні (вирощування та аналіз трансгенних рослин в умовах in vivo), статистичні (обробка отриманих результатів).
Наукова новизна отриманих результатів полягає у розробці платформи для редагування геному озимого ріпаку української селекції, а саме уперше:
- розроблено ефективну систему регенерації озимого ріпаку B. napus L. лінії Bn1 української селекції, яка дозволяє отримати насіння нульового покоління через рік після початку експериментів та при застосування якої не відбувається сомаклональна мінливість in vitro;
- оптимізовано умови Agrobacterium-опосередкованої генетичної трансформації озимого ріпаку лінії Bn1 української селекції та створено біотехнологічні рослини, стійкі до гербіциду фосфінотрицину;
- створено трансгенні рослини озимого ріпаку лінії Bn1, стійкі до гербіциду гліфосату, в результаті генетичної трансформації конструкціями pCB133, pCB135 та pSPG2254;
- створено генетичний вектор pSPE2053, що несе ген синтезу бактеріальної ендонуклеази Cas9; за використання цього вектора отримано трансгенні лінії озимого ріпаку, які в подальшому будуть використовуватися в селекційних програмах для здійснення редагування геному;
- створено генетичну конструкцію pSPE2058, що несе ген бактеріальної ендонуклеази Cas9; направляючі послідовності Aa1 та Аа2 для редагування геному ріпаку з метою накопичення олеїнової кислоти, а також селективний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази bar; конструкція буде використана для створення високоолеїнових ліній озимого ріпаку української селекції.
Практичне значення отриманих результатів. Біотехнологічні рослини ріпаку озимого лінії української селекції Bn1, стійкі до гербіциду гліфосату, можуть бути використані в подальших експериментальних дослідженнях та у селекційних програмах. Крім того, в якості платформи для редагування геному ріпаку, було створено генетичну конструкцію на основі системи CRISPR/Cas9, а також отримано біотехнологічні рослини, що несуть ген синтезу бактеріальної ендонуклеази Cas9.
Результати теоретичних та практичних досліджень:
- застосовуються в практичній діяльності ТОВ «БЕТА НК» при створенні біотехнологічних рослин ріпаку озимого із якісно новими ознаками (акт впровадження результатів науково-дослідної роботи подано у Додатку Б);
- можуть представляти інтерес для наукових та навчальних закладів, зокрема під час викладання біотехнології та генетики рослин.
