Дисертаційна робота висвітлює підходи метаболічної інженерії задля виявлення нових закономірностей у регулюванні біосинтезу рибофлавіну флавіногенними дріжджами Candida famata та подальшого застосування цих знань з метою створення стабільних суперпродуцентів цієї сполуки.
Рибофлавін (вітамін В2, або лактофлавін) відіграє важливу роль у метаболізмі живих організмів. Він є попередником флавінових кофакторів флавінмононуклеотиду (ФМН) та флавінаденіндинуклеотиду (ФАД). Зниження концентрації вітаміну В2 призводить до інгібування проліферації клітин, до запальних захворювань, таких як інфекційні запалення шкіри, хейліти, глосит, сепсису, катаракта та мігрені.
У промисловій продукції рибофлавіну дріжджі, як одноклітинні еукаріоти, мають вагомі переваги у біотехнологічних процесах порівняно із грибами та бактеріями. Розробка методів трансформації та запровадження метаболічної інженерії для модифікації геному цих організмів вже довели існування цікавого та перспективного напряму дослідження. Тому метою цієї роботи була ідентифікація та дослідження принципів дії нових чинників, залучених у процеси біосинтезу рибофлавіну флавіногенними дріжджами Candida famata.
Нами сконструювано штами дріжджів C. famata із пошкодженим геном синтезу субодиниці вакуолярної АТФ-ази (аденозонтрифосфатаза). Отримання делеційного мутанта дозволило продемонструвати, що ген VMA1 здійснює регуляторний вплив на утворення рибофлавіну досліджуваними дріжджами. У перерахунку на грам біомаси, отриманий штам продукує у 27 разів більше рибофлавіну, ніж вихідний штам. Крім того, ці дріжджі проявляли чутливий до температури фенотип. Ріст та флавіногенез штаму значно погіршилися при культивуванні за температури 35°C. Однак, одночасно вдалося з’ясувати, що батьківський штам C. famata є більш термотолерантним і, у відповідь на підвищенні температури, розпочинає синтезувати більше рибофлавіну, ніж при рості за 28°C.
Нами вивчено питання впливу промоторів гена SEF1 із різних, флавіногенних та нефлавіногенних, дріжджових організмів на ініціацію утворення рибофлавіну. Встановлено, що промотори SEF1 із флавіногенних дріжджів C. albicans та, меншою мірою, C. tropicalis, злиті з ВРЗ гена SEF1 із C. famata, впливають на здатність до відновлення надпродукції рибофлавіну у sef1Δ. Цей метод надекспресії гена допоміг підвищити рівень синтезу метаболіта у 20 разів.
Завдяки додатковому посиленню експресії гена GND1 вдалося підвищити вміст рибофлавіну у культуральній рідині у 2; 1,5 та 1,3 рази, порівняно із вихідними штамами L20105, AF-4 та BRP. Ми також показали, що надекспресія гена ZWF1, навпаки, інгібує біосинтез рибофлавіну та ростові процеси загалом.
У дисертаційній роботі вперше показано позитивний ефект дерепресії гена 6-фосфоглюконатдегідрогенази на синтез вітаміну B2 флавіногенними дріжджами.
Мутанти, що мали надекспресію обидвох генів ПФШ, а саме L20105/ZWF1/GND1, AF-4/ZWF1/GND1 та BRP/ZWF1/GND1 характеризувалися лише мінорним збільшенням кількості флавінів (не більше ніж у 1,05 рази, порівняно із батьківськими штамами).
Виявлено, що надекспресія гена SOL3 також здатна впливати на надсинтез рибофлавіну. Хоча цей позитивний вплив дуже незначний (збільшення виходу вітаміну на один грам біомаси від 1,05 до 1,5 разів), проте розкриває ще ширший потенціал обраного напрямку дослідження. Отже, надекспресія гена SOL3 у комбінації з GND1 та/або ZWF1 може привести до значно більшого накопичення рибофлавінового попередника Ру5Ф, а отже, ще більше стимулювати утворення рибофлавіну.
Ми також підтвердили, що мутантам із індукованою експресією гена фермента 6-фосфоглюконатдегідрогенази властиво синтезувати ще більші кількості рибофлавіну на середовищі з лактозою як єдиним джерелом Карбону. Так, вирощування штамів на молочній сироватці, в якій лактоза є єдиним джерелом вуглецю, сприяло ще більш інтенсивному утворенню вітаміну B2. Загалом зміна середовища культивування дозволила збільшити рівень синтезу у 1,4; 1,7 та 1,7 для штамів L20105/GND1, AF-4/GND1 та BRP/GND1, порівняно із синтезом на мінеральному середовищі з глюкозою.
Ми вперше дослідили локалізацію білка-екскретази Rfe1 (RiboFlavin Excretase) у дріжджів C. famata. Прикріплення флуоресцентної мітки до цього білка дозволило виявити, що Rfe1 знаходиться у плазматичній мембрані. Показали, що цей протеїн не функціонує у ядрі.
Викладені дані експериментальних досліджень є значущими для розуміння певних механізмів контролю над біосинтезом рибофлавіну. На щастя, у сучасному світі відбувається поступове виявлення дослідниками нових регуляторних чинників флавіногенезу. Наш вклад у цей поступ є важливим та може, в подальшому, сприяти створенню нових стабільних надпродуцентів рибофлавіну, а отже, підвищити рентабельність виробничих процесів. Зокрема, використання сироватки як субстрату для росту штамів дає ширші можливості зробити процес дешевшим і сприятливим для збереження стану навколишнього середовища, оскільки сироватка, зазвичай, утворюється як відходи молочної промисловості.
