Синюгіна А. Т. «Внутрішньоіонні барвники як зонди для флуоресцентної візуалізації клітин і потенційні реагенти для фотодинамічної терапії» – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 Біологія (09 – Біологія) - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2023.
Дисертація присвячена пошуку нових флуоресцентних внутрішньоіонних поліметинів на основі мероціанінових та сквараїнових барвників як реагентів для візуалізації клітин і фотодинамічної терапії.
Флуоресцентна візуалізація з використанням поліметинових барвників є важливим інструментом для біомедичних досліджень. Найбільш перспективними є поліметинові барвники, які поглинають та випромінюють світло у ближньому червоному діапазоні. Це дозволяє зменшити фоновий сигнал та покращити якість зображення. Довгохвильові барвники поліметинового ряду використовуються як реагенти для флуоресцентної візуалізації клітин та як фотосенсибілізатори для проведення фотодинамічної терапії.
Для біологічних застосувань найчастіше використовуються катіонні ціанінові барвники, оскільки вони мають високі значення квантових виходів флуоресценції та молярних коефіцієнтів екстинкції. Однак відомо, що катіонні барвники здатні до селективного накопичення в мітохондріях клітин, що ускладнює їхнє неспецифічне розподілення в об’ємі клітини, конструювання кон’югатів для адресної доставки потрібних нам лігандів. Тому виникає потреба вдосконалення методів флуоресцентного мічення, а саме пошук мінімізації впливу барвника на фармокінетику його кон’югату. Одним із рішень є розробка довгохвильових флуоресцентних барвників, що не містять заряду чи заряд є скомпенсованим всередині молекули. Використання внутрішньоіонних барвників допоможе розширити практичні можливості для флуоресцентної візуалізації клітин та дизайну адресних флуоресцентних кон’югатів. До внутрішньоіонних барвників відносять мероціанінові та сквараїнові барвники.
Досліджені спектральні властивості ряду нових мероціанінових барвників із мезо-замісниками в поліметиновому ланцюзі, які поглинають світло в області понад 600 нм. Їх спектральні характеристики вивчені у метанолі, водному буфері та в присутності глобулярних білків. На основі експериментальних даних розраховані константи зв’язування мероціанінових барвників із людським сироватковим альбуміном та показано, що жорстка фіксація поліметинового ланцюга шляхом введення мезо-замісників в поліметиновий ланцюг сприяє зростанню констант зв’язування із білком. Утворення нековалентних комплексів із альбумінами впливає на спектрально-флуоресцентні властивості барвників, зокрема, спостерігається зростання інтенсивності флуоресценції, квантових виходів флуоресценції та зміщення максимумів поглинання в довгохвильову частину спектрального діапазону. Були передбачені можливі сайти зв’язування мероціанінів на поверхні білкової молекули людського сироваткового альбуміну за допомогою молекулярного докінгу. За результатами проточної цитометрії встановлено, що синтезовані мероціаніни проникають у клітини А2780. За результатами флуоресцентної мікроскопії живих клітин А2780 та проведеної колокалізації із мітохондріально-специфічним барвником родамін-123 та барвником селективним до ядерного хроматину Hоechst3342, показано, що мероціаніи локалізуються в мітохондріях без вираженої специфічності і не проникають до ядра клітин. Окрім того, за результатами МТТ-аналізу встановлено, що барвники з фенільними та амінодифенільними замісниками в мезо-положенні поліметинового ланцюга не проявляють цитотоксичної дії на клітини MCF-7 в представленому діапазоні концентрацій та часом інкубації 24 години.
Типовими представниками бетаїнів є барвники на основі квадратної кислоти – сквараїнові (скварилієві) барвники. Науковий інтерес до фотохімії сквараїнів пов'язаний з їх фотостабільністю, високою інтенсивністю флуоресценції та здатністю генерувати активні форми Оксигену при опроміненні світлом відповідної довжини хвилі. На клітинній лінії MCF-7 була досліджена темнова та світлова токсичність барвників із метильними, сульфо- та карбоксильними N,N’-алкільними замісниками. За результатами МТТ-аналізу виявлено, що усі три сквараїнові барвники генерують активні форми Оксигену при опроміненні червоним світлом та спричинюють загибель клітин у безсироватковому середовищі. Барвники з N,N’-алкільними гідрофільними групами не демонстрували токсичність у присутності 5% бичачого альбуміну навіть за їх високих концентраціях. В той же час для сквараїнового барвника із N,N’-метильними замісниками виживання клітин MCF-7 при опроміненні лазером знижувалось майже на 40% за концентрації 0,1 μМ і майже на 90% за концентрації 10 μМ, навіть за присутності альбуміну. Отже, сквараїновий барвник із N,N’-метильними замісниками може використовуватися як потенційний фотосенсибілізатор для фотодинамічної терапії.
