Шадріна Р. Ю. Роль аутофагії у відповіді Аrabidopsis thaliana на вплив мікрогравітації та участь мікротрубочок в опосередкуванні цього процесу

Дослідження присвячене аналізу процесів аутофагії в рослинах Arabidopsis thaliana під впливом мікрогравітації з особливим акцентом на ролі мікротрубочок. Аутофагія як внутрішньоклітинний механізм деградації та рециркуляції макромолекул і органел виступає ключовим фактором в адаптації рослин до стресових умов. На сьогодні вивчення фізіологічної ролі аутофагії при стресі є однією з актуальних проблем біології, оскільки в залежності від ступеня пошкодження клітин цей процес може сприяти або виживанню, або загибелі клітин. Тому у даному дослідженні зосереджено увагу на вивченні розвитку процесів аутофагії, а також ролі цитоскелету, зокрема мікротрубочок, у рослин в умовах зміненої гравітації. Вивчення адаптації рослин до зміненої гравітації є ключовим для розвитку систем життєзабезпечення в космосі. Нещодавно було показано, що Arabidopsis thaliana та інші види рослин можуть розвиватися та давати урожай насіння у космічних умовах, проте за таких умов розвитку вони зазнають певних молекулярних змін [1, 2]. Дослідження адаптації рослин за участю аутофагії в змодельованих умовах є надзвичайно актуальним, оскільки дає змогу створити фундамент для подальших космічних досліджень із вирощуванням рослин, а далі – для отримання продуктів харчування в умовах зміненої гравітації. Як матеріал досліджень використовували рослини A. thaliana екотипу Columbia Col-0 та адві трансгенні лінії A. thaliana: GFP-ATG8a та GFP-MAP4. Стресові умови моделювали за допомогою кліностату, на якому вирощували рослини (режим обертання 4 об/хв). Використання кліностату дозволяє імітувати умови мікрогравітації, що є важливим для дослідження адаптаційних механізмів рослин. Візуалізацію аутофагосом здійснювали за допомогою лазерної конфокальної мікроскопії. Цей метод дозволяє отримати детальні зображення внутрішньоклітинних структур та процесів, що є ключовим для аналізу аутофагії. За допомогою молекулярно-генетичних методів оцінювали експресію генів білків ATG, α- і β-тубулінів в досліджуваних рослинах. Ці методи дозволяють кількісно оцінити рівні експресії генів та виявити зміни, які виникають під впливом мікрогравітації. Було проаналізовано вплив мікрогравітації на ріст та розвиток проростків A.thaliana. У результаті проведених досліджень нами було виявлено, що кліностатування не впливало на проростання насіння, а також не викликало суттєвих відхилень у морфології пагонів проростків. Затримка в розвитку пагонів спостерігали лише на 6-ту та 9-ту добу кліностатування, на 12-ту добу пагони практично морфологічно не відрізнялися від контрольних рослин. Також 12-денні проростки мали правильну листкову розетку, яка складалася з 4–6 овальних зелених листків. У той же час проростки, що зростали в експериментальних умовах, на відміну від контролю мали дезорієнтований ріст коренів, що було наслідком постійної зміни вектора сили тяжіння. При аналізі морфології та розвитку головних коренів проростків були виявлені відмінності в їх зонах росту. Зокрема, зони розтягу та перехідна були коротшими за умов кліностатування в порівнянні із контрольними рослинами. Кількісний аналіз середньої площі епідермальних клітин в перехідній зоні показав незначні відмінності (менше на 29 %) у розмірах досліджуваних рослин порівняно із контролем. Також було проаналізовано кут гравітропічного нахилу (GSA). Результати показали значне збільшення GSA у проростків A. thaliana в умовах кліностатування, що свідчить про відхилення від нормальної вертикальної орієнтації коренів, як, наприклад, у контролі. Методами флуоресцентної та конфокальної лазерної скануючої мікроскопії було проведено дослідження розвитку стрес-індукованої аутофагії на морфологічному рівні. Виявлено характерні ознаки розвитку аутофагії під впливом мікрогравітації, зокрема збільшення кількості аутофагосом у клітинах кореня. За допомогою флуоресцентного барвника MDC було виявлено появу структур розміром від 3 до 20 мкм, що свідчить про активний розвиток аутофагії під впливом стресових умов мікрогравітації. Отримані результати за використання барвника LTR та трансгенної лінії A. thaliana (GFP-ATG8a) в обох випадках показали індукцію аутофагії та максимальний рівень утворення аутофагосом у епідермальних клітинах кореня перехідної зони рослин A. thaliana після 6-ти діб культивування. Визначено кількість аутофагосом за допомогою трансгенної лінії A. thaliana GFP-ATG8a. Результати показали значне збільшення кількості аутофагосом у клітинах, що знаходилися під впливом мікрогравітації, що свідчить про активацію аутофагії як захисного механізму. На 6-ту добу вирощування спостерігалася найбільш суттєва зміна кількості аутофагосом (більше ніж у 2 раза) порівняно з контролем, хоча на 9-ту добу кількість аутофагосом зменшилася у клітинах перехідної зони кореня, їх було все одно більше, ніж у контрольних рослинах. На 12-ту добу вирощування кількість аутофагосом у клітинах коренів рослин в умовах кліностатування була подібною до контрольних рослин.