Маланчук О. М. Ідентифікація білків-партнерів туберозно-склерозного комплексу TSC1/2 та характеристика виявлених взаємодій

1.Об'єкт - молекулярні механізми функціонування сигнальних систем клітини. Мета - пошук нових функціональних взаємодій комплексу TSC1/2 методом двогібридної системи дріжджів, а також з'ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій в клітинах вищих евкаріотів. Методи - двогібридна система дріжджів, клонування фрагментів кДНК, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК-конструкціями, експресія та афінна очистка рекомбінантних білків, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, імуноцитохімія; гібридомна технологія, аналіз білково-білкових взаємодій за допомогою реципрокної ко-імунопреципітації білкових комплексів, кіназна реакція in vitro, фосфатазна реакція in vitro. Результати та новизна - методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано 10 TSC2-зв'язувальних білків, серед яких адапторні білки родини 14-3-3, білки протеасомного комплексу та серин/треонінова протеїнфосфатаза 5. Вперше отримано та охарактеризовано моноклональні антитіла проти TSC2. Специфічність утворення комплексу TSC2/РР5 доведено намоделі клітин ембріональних фібробластів мишей за допомогою методу реципрокної ко-імунопреципітації. Вперше показано, що ефективність взаємодії TSC2 з РР5 залежить від фізіологічного стану клітин, а саме: комплексоутворення TSC2/РР5 підсилюється в клітинах, що активно проліферують. Вперше показано здатність РР5 дефосфорилювати in vitro TSC2 за потенційними сайтами фосфорилювання АМРК. Запропоновано модель регуляції активності TSC2 шляхом РР5 опосередкованого дефосфорилювання.