Телегєєв Г. Д. Мієлопролифератівні захворювання: молекулярний патогенез та діагностіка

Роботу присвячено вивченню молекулярного патогенезу хронічної мієлоїдної лейкемії (ХМЛ) та розробці діагностичних і моніторингових методів мієлопроліферативних неоплазм. Запропоновано новий підхід до виявлення та диференційної діагностики Ph-позитивних лейкемій, який дозволяє виявляти як класичні, так і можливі неканонічні типи перебудов в bcr ділянці химерного гена bcr-abl. Запропоновано тест - системи для виявлення bcr-abl перебудови, мутації в Abl-кіназному домені та мутації V617F при МПЗ. За допомогою зворотно - транкриптазної полімеразної ланцюгової реакції показано , що у деяких хворих на ГЛЛ та ХМЛ з p210 bcr-abl мРНК на гострій стадії захворювання відбувається втрата різних за протяжністю ділянок DH домену. Описано 7 нових варіантів химерної bcr-abl мРНК. Проаналізовано наслідки виявлених змін на характер функціонування білка. Зокрема, на актиновий цитоскелет полімофноядерних лейкоцитів, де спостерігається різне клітинне розташування: дифузійне, кортикальне та "dot-like" розташування (у хворого з бластною кризою). З метою дослідження наявності та рівня експресії нормального білка Bcr нами було проекспресовано, очищено і використано для отримання поліклональних антитіл рекомбінантні DH та PH домени Bcr. Результати Вестерн-блот аналізу з використанням лізатів клітин хворих на ХМЛ свідчать про наявність зворотного негативного зв'язку між експресією білків Bcr та Bcr-Abl. Отримані антитіла дають змогу детектувати нормальний білок Bcr і дозволяють розробити комплексний підхід для детекції bcr-abl - перебудови. Клоновано ділянки гена bcr, що відповідають DH і PH доменам, а також тандему DHPH білка Bcr та отримано рекомбінантні білки DH, РН і DHPH. Вперше проведено дослідження GEF - активності DH домену Bcr окремо і разом з РН доменом методом "pull down" - аналізу. Показано, що в нього відсутня GEF - активність щодо Rho-ГТФаз підкласів RhoA, Cdc42 і Rac1 in vitro і in vivo. Визначено ліпіди, що зв'язуються з РН доменом Bcr з високою афінністю. Методами "pull down", двовимірного електрофорезу і мас-спектрометрії вперше показано взаємодію РН домену Bcr з білками, підтверджено зв'язування з білками SMC1, тубулін, зизимін1, PLC. Показано вплив РН домену на субклітинну локалізацію білка Bcr-Abl. Ключові слова: Bcr-Abl, DH домен, PH домен, хронічна мієлоїдна лейкемія, ХМЛ, гостра лімфобластна лейкемія, ГЛЛ, ген bcr-abl, jak 2 ген, діагностика.