Дисертаційна робота присвячена вивченню спектроскопічних властивостей флуоресцентних амінокислот на основі 3-гідроксихромону, їх впливу на структуру біологічно активних пептидів, до яких вони включені, а також синтезу нових похідних флуоресцентних амінокислот на основі 3-гідроксихромону.
В літературному огляді, що містить 89 посилань та 10 рисунків, описано властивості та застосування флуоресцентних амінокислот різних класів. Аналіз літератури показав, що більшість описаних прикладів стосуються амінокислот з кон’югованими хромофорами, а вибір флуоресцентних амінокислот, які могли б бути включеними в пептиди методом твердофазного пептидного синтезу відносно обмежений. Цікавими за своїми властивостями виявилися флуоресцентні амінокислоти з внутрішньомолекулярним переносом протону (ESIPT).
Першим етапом було дослідження флуоресцентних аналогів антимікробного пептиду cWFW на предмет впливу флуоресцентної мітки на будову та функцію пептиду за допомогою заміни наявних в cWFW ароматичних амінокислот на 3-гідроксихромонвмісну флуоресцентну амінокислоту (FHC).
На цьому етапі була валідація мітки за допомогою CD-спектрополяриметрії та порівняння біологічної активності флуоресцентно-мічених пептидів. CD-спектр cRW-F2/FHC був найменш подібним до спектру cWFW. На відміну від цього, обидва пептиди з заміщеними Trp на FHC мітку, мали подібні спектри до спектрів cWFW. Усі мічені пептиди продемонстрували однакову (в межах помилок експерименту) бактеріостатичну активність, яка відрізнялася від МІК неміченого cWFW, але лише на два розведення. Аналіз гемолітичної активності, навпаки, виявив збільшену активність усіх трьох мічених пептидів порівняно з cWFW. Пептид cRW-F2/FHC був найбільш гемолітичним, але був менш полярним, ніж обидва аналоги cRW-Trp. Для оцінки клітинопроникної активності флуоресцентні аналоги cWFW інкубували з адгезивною культурою клітин HeLa і оцінювалась здатність пептидів проникати в клітини за допомогою конфокальної флуоресцентної мікроскопії. Мічені FHC пептиди дійсно потрапляли в клітини, демонструючи як цитозольне, так і мікросомальне проникнення. Відмінностей між трьома аналогами cWFW виявлено не було. З отриманих в результаті досліджень даних було зроблено висновок, що FHC не чинить значного порушення структури та функцій cWFW в порівнянні з нативним неміченим пептидом, а також що серед трьох аналогів, cRW-W3/FHC поводиться найближче до неміченого пептиду.
Наступним кроком було дослідження фотофізичних властивостей флуоресцентних аналогів cWFW. Було зроблено та проаналізовано спектри флуоресценції пептидів (збудження при 365 нм) у PB, TFE та етанолі. Отриманні спектри, підтвердили, що положення та відносна інтенсивність смуг емісії T*/N* залежить від полярності розчинників та їх здібності до утворення водневих зв’язків. Було записано спектри поглинання для пептидів у розчинниках різної полярності. При цьому було зареєстровано значний сольватохромізм у спектрах поглинання флуоресцентних аналогів сWFW, який корелював зі змінами в спектрах емісії. Послідовне збільшення основності розчинника пояснює спектральні зміни в порядку: вода > РВ > етанол > ДМФА, та не пояснює екстремального зсуву максимуму поглинання аніонної форми до 455 нм у ДМФА. Було зроблено припущення, що аномальний батохромний зсув максимумів поглинання може бути результатом внутрішньомолекулярних взаємодій бічних замісників. Гуанідинові групи катіонних залишків аргініну можуть перебувати в безпосередній близькості до залишку FHC, сприяючи утворенню аніонної форми та модулюючи квантовий вихід флуоресценції, що підтверджується молекулярним моделюванням (методом молекулярної механіки).
Було проведено виміри МІК, використовуючи два репрезентативних штами бактерій: грамнегативну E. coli та грампозитивну B. spizizenii за допомогою стандартного методу дворазового розведення. Майже всі мічені пептиди продемонстрували однакову бактеріостатичну активність на грамнегативних бактеріях, яка виявилась набагато нижчою і відрізнялася від МІК природного GS (як і інвертованого) більш ніж на чотири розведення для грамнегативних і на чотири для грампозитивних бактерій. Пептиди з FHC та NMPHC продемон
