Позаклітинні везикули (EVs) складають гетерогенну популяцію нано/мікророзмірних мембранних везикул, що постійно секретуються в позаклітинне середовище практично всіма дослідженими типами клітин як за нормальних фізіологічних, так і патологічних станів. EVs містять нуклеїнові кислоти, протеїни з різним функціональним потенціалом, сигнальні молекули та метаболіти, що дозволяє їм відігравати провідну роль у міжклітинній комунікації. Проте, глибина вивчення EVs, що містяться в низці біологічних рідин та продукуються пухлинними клітинами, все ще залишається недостатньою. Тому, метою дисертаційної роботи стало дослідити особливості продукування, молекулярний склад та функціональні властивості EVs, ізольованих з поту людини та кондиціонованого середовища псевдонормальних та пухлинних клітин, з’ясувати вплив нормоксії/гіпоксії й адаптерного протеїну Ruk/CIN85 на зазначені показники.
Встановлено, що EVs з поту людини містять DNA та RNA людського (74% зчитувань цих зразків відповідали геному людини (70% - tRNA, інші типи RNA - 18,5%, mRNA - 5%, miRNA - 1,85%) і 29% - неанотованим областям) і мікробного походження (бактерій, архей і вірусів, типових для мікробіому шкіри).
Протеїновий склад EVs людського поту та зразків поту, зібраних з альгінатних пластирів продемонстрував присутність 1209 унікальних протеїнів людини, з яких ~ 20% були присутні у кожному індивідуальному дослідженому зразку, маркер екзосом CD63, 846 протеїнів (70%), спільних з загальним потом, і 368 протеїнів (30%) – з альгінатним пластиром, а також 1594 протеїнів бактерійного походження.
Вплив гіпоксії на клітини аденокарциноми нирки призводить до посилення секреції EVs й помітних змін їх протеїнового вантажу порівняно з нормоксією. За допомогою LS-MS-аналізу в зразках «гіпоксичних» EVs виявлено надмірну присутність інтегринів, протеїнів, які беруть участь у забезпеченні адгезивності клітин.
Вивчення хімічного складу препаратів EVs, що продукуються клітинами аденокарциноми нирки, за допомогою обмеженої в часі Раманівської спектроскопії та підсиленої поверхнею обмеженої в часі Раманівської спектроскопії виявило характерні зміни у амідних областях через зміни хімічних зв’язків у протеїнах EVs за умов гіпоксії. TG-RS та TG-SERS є перспективними безмітковими технологіями для вивчення впливу зовнішніх стимулів (гіпоксія) на склад EVs та відмінностей, що виникають внаслідок використання різних протоколів очищення EVs.
Характеристика EVs, з кондиціонованого середовища клітин карциноми нирки миші лінії Renca з надекспресією адаптерного протеїну Ruk/CIN85 (Renca-RukUp) та контрольних клітин Renca-Mock за умов нормоксії та гіпоксії показала, що концентрація частинок, що продукуються клітинами Renca-RukUp, виявилася на порядок вищою за умов гіпоксії у порівнянні з умовами нормоксії. За нормоксії вміст протеїнів Ruk/CIN85, Alix і CD81 зростав у везикулах з клітин Renca-RukUp у порівнянні з клітинами Renca-Mock. За гіпоксії вміст досліджуваних протеїнів зменшувався більш ніж на 2 порядки у EVs з клітин Renca-RukUp, а вміст Ruk/CIN85 і CD81 зростав у EVs з Renca-Mock. Таким чином, Ruk/CIN85 є новим компонентом EVs, що продукуються пухлинними клітинами, який може відігравати регуляторну роль у контролі складу EVs за умов нормоксії та гіпоксії.
Характеристика EVs, очищених з кондиціонованого середовища клітин ембріональної нирки людини лінії НЕК293, стабільно трансфікованих вектором ЕGFP-Ruk/CIN85 (НЕК293 ЕGFP-RukUp), продемонструвала, що ЕGFP-Ruk/CIN85 є компонентом EVs, що продукуються клітинами НЕК293 ЕGFP-RukUp, при цьому EVs з надекспресією ЕGFP-Ruk/CIN85 здатні диференційно модулювати проліферативні властивості та рухливість клітин in vitro. Більшість ідентифікованих протеїнів, що диференційно експресуються в клітинах НЕК293 ЕGFP-RukUp і виявляються в EVs, є метаболічними ензимами.
EVs, що продукуються пухлинними клітинами аденокарциномних клітин грудної залози миші лінії 4Т1 з надекспресією або зниженою експресією Ruk/CIN85, RukUp та RukDown, відповідно, містять Ruk/CIN85, характеризуються специфічними профілями вмісту його численних молекулярних форм та здатні модулювати проліферативну активність, рухливість і інвазивність клітин 4T1 WT. Таким чином, Ruk/CIN85 є конститутивним компонентом протеїнового складу EVs пухлинних клітин і , залежно від його вмісту в EVs, відіграє активну роль у контролі канцерогенезу.
